RevM First Strand cDNA

Преимущества:
• Высокий выход продукта длиной до 10 т.н.
• Оптимальная рабочая температура 55°C
• Наличие вспомогательных компонентов в составе набора: ингибитор РНКаз, смесь случайных 6-нуклеотидных праймеров и олиго(dT)18
Область применения:
• ОТ-ПЦР, в том числе с детекцией результатов в режиме реального времени
• Получение полноразмерных библиотек кДНК
• Синтез антисмысловой РНК (-RNA)
• Анализ РНК путём удлинения праймера
• Синтез кДНК для молекулярного клонирования
• ОТ-ПЦР, в том числе с детекцией результатов в режиме реального времени
Активность фермента:
Одной единицей активности определяется такое количество фермента, которое включит 1 нмоль dTTP в растущую цепь кДНК за 30 минут при 74°С, используя полиА-dT18 в качестве матрицы.
Условия хранения и транспортировки
• От -24°C до -16°C - 1 год
• От +2°C до +8°C - 14 дней

Состав набора:

СОСТАВ НАБОРА


ОПИСАНИЕ ПРОДУКТА

Набор для синтеза кДНК RevM представляет собой полную систему для эффективного синтеза первой цепи кДНК из матриц мРНК или тотальной РНК. Он содержит ревертазу RevM — генетически модифицированную обратную транскриптазу, выделенную из вируса лейкоза мышей (M-MuLV), которая отличается от M-MuLV дикого типа по структуре, каталитическим свойствам и температурному оптимуму активности.

Данный фермент характеризуется РНК- и ДНК-зависимой полимеразной активностью, но не проявляет активности РНКазы H. Температурный оптимум для его активности составляет 55 °C (активность сохраняется при температуре до 60 °C включительно). Фермент RevM способен синтезировать кДНК длиной до 10 т.п.н. и включать модифицированные основания.

Ингибитор рекомбинантных РНКаз, входящий в набор, представляет собой рекомбинантный плацентарный белок человека массой 50 кДа, экспрессируемый в Escherichia coli. Он ингибирует активность рибонуклеаз эукариот (РНКазу A, РНКазу B и РНКазу C), что предотвращает распад РНК.

Для хранения образцов РНК рекомендуем буфер для хранения РНК (#, БелБиолаб). Буфер для хранения РНК подходит для хранения мазков/ биопрепаратов, содержащих РНК. Для надежного хранения РНК требуется до трехкратного превышения объема буфера к объему образца. В отличии от консервантов включающих ГТЦ или аналоги пригоден для методов прямой амплификации ДНК/РНК полимеразой blitz (#E-BLP-0.25, БелБиолаб) и One-step direct (#, БелБиолаб).

ПРОТОКОЛ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Для приложений ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени матрица РНК не должна содержать загрязнений ДНК. Для удаления следовых количеств ДНК кДНК РНК перед синтезом может обрабатываться ДНКазой I (#?), не содержащей РНКазы. Всегда проводят контрольную реакцию (ОТ-минус), которая включает все компоненты для ОТ-ПЦР, за исключением обратной транскриптазы.

Перед началом анализа важно учесть следующее:
- следует использовать виды пластика, не содержащие РНКаз;
- при работе с РНК и другими реагентами необходимо всегда использовать перчатки, поскольку кожа является источником РНКазы.
- используемые реагенты не должны содержать РНКазы, в том числе высокоочищенная вода;
- необходимо использовать ингибитор РНКаз для защиты от РНКаз;

1. Разморозить все компоненты реакционной смеси и матрицы РНК.
2. Готовить реакционную смесь в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1. Состав реакционной смеси (20 мкл)
* При использовании праймеров, специфичных для представляющего интерес гена, применяемая концентрация может составлять 10–20 пмоль/реакция.
** Концентрация ревертазы RevM может варьироваться в пределах 50–200 единиц на реакцию (объем: 20 мкл).

Для большинства приложений подходящей начальной точкой является 100 Ед/реакция.

3. Тщательно перемешать реакционную смесь и внести соответствующие объемы в пробирки или планшеты для ПЦР.
4. Запрограммировать термоциклер в соответствии с программой, описанной в таблицах 2 и 3.

Таблица 2. Программа амплификации для случайного гексамерного праймера и праймера олиго(dT)18


Таблица 3. Программа амплификации для ген-специфического праймера


Для последующего анализа кДНК методом ПЦР рекомендуется использовать не более 2 мкл полученного образца на реакцию амплификации объемом 25 мкл.

Для ПЦР с химической детекцией зонда рекомендуется использовать мастер-микс 5Х Fast Probe qPCR U (#M5-FPU, БелБиолаб). Для обнаружения с помощью интеркалирующего красителя, входящего в готовую ПЦР-смесь 5X Fast Dye U (#M5-FDU, БелБиолаб).

Образец кДНК можно хранить не менее месяца при температуре –20 °C.

Более длительное хранение осуществляется при температуре –70 °C.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВКИ

• От –24 до –16 °С: 2 года.
• От +2 до +8 °C: 3 месяца.
• Не выше +25 °С: 14 суток.

Только для исследовательской работы. Товар не предназначен для медицинских целей!

ФАСОВКИ




Смотреть
Скачать