Phi29 ДНК- полимераза

Преимущества:
•Высокая процессивность
•Высокая точность

Область применения:
• Изотермическая амплификация ДНК для секвенирования или клонирования
• Амплификация по типу катящегося кольца
• Множественная амплификация с вытеснением цепи
• Амплификация ДНК для детекции SNP и STR-маркеров
• Амплификация ДНК с использованием белка или РНК

Концентрация:
10 еа/мкл (5-50 еа/мкл по запросу)
Одной единицей определяется количество молекул фермента, включающих 15 пмоль дезоксинуклеотидтрифосфатов в растущую цепь ДНК за 10 минут при 30°С.

Буфер для хранения и разбавления:
20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1 mM EDTA, 100 mM KCl, 0.5% Tween-20, 2 mM TCEP, 50% glycerol

Условия хранения и транспортировки:
●От -24°С до -16°С – 1 год
●От +2°С до +8°С – 14 дней

ОПИСАНИЕ ПРОДУКТА
Рекомбинантная ДНК-полимераза phi29 — это классический фермент, который предназначен для использования в обычных приложениях изотермической амплификации ДНК при умеренной температуре (на основании активности замещения цепи). Фермент поставляется с оптимизированным высокоэффективным буфером. Пользователь добавляет дНТФ, матрицу и праймеры. Данная полимераза высокоактивно замещает цепи и эффективно катализирует полимеризацию в направлении 5’–3’ при температуре около 4–35 °C. У phi29 присутствует 3’–5’ экзонуклеазная активность, в направлении 5’-3’ - отсутствует. Phi29 может разрушать праймеры, поэтому рекомендуется использовать модифицированные в 3’-положении праймеры для устойчивости к экзонуклеазе. Фермент может инактивироваться нагреванием, устойчив к дУТФ и продуцирует ДНК с «тупыми» концами.

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
• Изотермическая амплификация ДНК
• Амплификация методом катящегося кольца (RCA)
• Амплификация с множественным вытеснением (MDA)

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ
1 год при температуре от –24 до –16 °С

СТАНДАРТНЫЙ ПРОТОКОЛ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРОДУКТА
1. Размораживают и хранят реагенты на льду. Перед использованием — тщательно перемешивают.
2. Проводят отжиг праймеров / денатурацию путем нагревания реакционной смеси 1 при температуре 95 °C с последующим быстрым охлаждением. Только после этого добавляют смесь 2 с полимеразой phi29.
3. Проводят реакцию при температуре 30 °C. При необходимости оптимизируют ее в диапазоне значений 4–35 °C для каждой системы матрицы/ праймеров.
4. Предлагаемое время реакции составляет 180–360 мин. Для некоторых мишеней при малом числе копий может потребоваться инкубация в течение ночи.
5. В ходе амплификации вязкость раствора может повышаться.

Таблица 1. Реакционная смесь 1


6. Осторожно перемешивают реакционную смесь и осаждают капли со стенок пробирки.
7. Помещают в термостат или прибор для кПЦР для отжига праймеров (таблица 2).
8. Готовят реакционную смесь 2 в соответствии с таблицей 3.
9. Смешивают реакционную смесь 1 с реакционной смесью 2 и инкубируют полученную смесь при температуре 30 °C в течение 3–6 ч для синтеза ДНК.
10. Фермент можно инактивировать путем выдерживания при температуре 65 °C в течение 10 мин.
11. Температура продолжительного хранения реакционных смесей должна составлять –20 °C, а непродолжительного — +4 °C.

Таблица 2. Отжиг праймеров / денатурация



Таблица 3. Реакционная смесь 2


Буфер для хранения и разведения:
20 мМ трис-HCl (pH 7,5), 0,1 мМ ЭДТА, 100 мМ KCl, 0,5 % твин-20, 2 мМ трис-(2-карбоксиэтил) фосфина, 50 % глицерина

Реакционный буфер P (1X):
50 мМ трис-HCl, 10 мМ (NH4)2SO4, 10 мМ MgCl2, 2 мМ трис-(2-карбоксиэтил)фосфина, 0,1 % твин-20 (pH 7,5, 25 °C)

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ
1 год при температуре от –24 до –16 °С

Смотреть
Скачать