Набор для быстрого лигирования (НБЛ)

р.

Купить

Набор для быстрого лигирования содержит ДНК-лигазу фага T4, которая катализирует образование фосфодиэфирной связи между 5'-фосфатной и 3'-гидроксильной группами в двухцепочечных ДНК или РНК, с тупыми или липкими концами.
Фермент восстанавливает одноцепочечные разрывы в двухцепочечных ДНК и РНК или гибридах ДНК-РНК, но фермент не активен в отношении одноцепочечных нуклеиновых кислот.
По сравнению с традиционным лигированием НБЛ увеличивает в среднем эффективность лигирования нуклеиновых кислот с тупыми концами в 10 раз и с липкими концами в 3 раза.

Преимущества
● лигирование за 5 минут
● в 3-10 раз более высокая эффективность, чем у традиционного лигирования

Состав набора:

Компоненты	KFL-25	KFL-25	KFL-25	Температура хранения
Т4 ДНК лигаза	28 мкл	55 мкл	165 мкл	-20°С
Реакционный буфер	140 мкл	275 мкл	825 мкл	-20°С
Вода ультрачистая	1.5 мл	1.5 мл	2х1.5 мл	от -20°С до +20°С

Примечания:

Вектор для клонирования и вставка ДНК должны быть растворены в воде или буфере Tris (10 мМ Tris HCl, pH 8.0).
В смеси для лигирования рекомендуется использовать стандартные количества вектора и вставки ДНК. Молярное соотношение клонирующего вектора к вставке ДНК должно составлять 1:3 (например, 0,020 пмоль вектора ДНК к 0,060 пмоль вставки ДНК).
Лигазу не следует термически инактивировать. Термическая инактивация значительно снижает эффективность трансформации.
Не рекомендуется увеличивать время лигирования более чем на 10 минут.

Протокол лигирования:
1. Разморозьте все компоненты, поместите в лёд
2. Смешайте пипетированием все компоненты
3. Инкубируйте 5 минут при комнатной температуре (21°C - 23°C)
4. Держите на льду до трансформации или храните на -20°C.

Примечание. Для примера количество вектора и вставки (нг) приведено с вектором длиной 4 кб и вставкой длиной 1 кб.

Общий объем	20 мкл
Т4 ДНК лигаза	1 мкл
Буфер для быстрого лигирования	5 мкл
Вектор ДНК	0.02 пмоль*
Вставка ДНК	0.06 пмоль*
Вода ультрачистая	довести до конечного объема 20 мкл

*Формула расчета концентрации ДНК
Для расчета количества пмоль каждого фрагмента на основе длины и массы фрагмента ДНК рекомендуется следующая формула:
пмоль = (масса в нг) x 1000 / (п.н. x 650 дальтон)

Длина фрагмента ДНК п.н.	Количество фрагмента ДНК 0,1 пмоль
200	6,5 нг
300	19,5 нг
500	32,5 нг
1000	65 нг
2000	130 нг
3000	195 нг
4000	260 нг
5000	325 нг

Трансформация E. coli
Смесь для реакции может быть непосредственно использована для трансформации компетентных клеток E. coli химическими методами или методом электропорации. Для трансформации рекомендуется использовать набор для трансформации.