ОПИСАНИЕ ПРОДУКТА ДНК-полимераза Blitz — это термостабильная ДНК-полимераза, получаемая из термофильной археи Pyrococcus furiosus. Модификации аминокислотной структуры ДНКполимеразы Pfu приводят к увеличению процессивности и скорости синтеза (т.п.н./ 20с) и производительности амплификации, а также позволяют наращивать длинные матрицы за короткий промежуток времени. Это позволяет расценивать ДНК-полимеразу Blitz как приоритетный инструмент клонирования. Этот фермент подходит для всех приложений ПЦР, требующих повышенной точности или синтеза длинных ампликонов (до 50 к.п.о.). Этот фермент обладает 3’→5’ экзонуклеазной (корректирующей) активностью в направлении, но лишен 5’→3’ экзонуклеазной активности, что важно для зондов c дизайном TaqMan.
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ • ПЦР с повышенной точностью синтеза
• Амплификация длинных фрагментов ДНК
• Прямая ПЦР без очистки образцов
• Подготовка библиотеки для NGS
УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВКИ• От –24 до –16 °С: 1 год.
• От +2 до +8 °C: 14 суток.
СТАНДАРТНЫЙ ПРОТОКОЛ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРОДУКТАПеред началом анализа важно учесть следующее:
1. Чтобы уменьшить ошибку пипетирования при подготовке нескольких параллельных реакций, рекомендуется приготовить общую готовую смесь для ПЦР, содержащую все компоненты смеси (вода, дНТФ, буфер, ДНК-полимераза, праймеры), за исключением матрицы ДНК. Объем готовой смеси для ПЦР рассчитывают на основании количества реакций с добавлением одного дополнительного образца. В предварительно маркированные пробирки для ПЦР добавляют сначала аликвоты готовой смеси для ПЦР, а затем – соответствующую ДНК-матрицу.
2. Размораживают все реагенты, матричную ДНК и праймеры.
3. Готовят реакционную смесь в соответствии с таблицей 1.
4. Количество вводимых компонентов приведено для одной реакции с объемом реакционной смеси 50 мкл.
5. Осторожно перемешивают реакционную смесь и осаждают капли со стенок пробирки.
6. Проводят ПЦР в соответствии с параметрами, указанными в таблице 2.
Таблица 1. Схема ПЦР для амплификации длинных фрагментов ДНККомпонент | Объем, мкл/ 50 мкл реакционной смеси | Конечная концентрация |
2,5X буфер B* | 20 мкл | 1× |
Смесь дНТФ (каждый в концентрации 10 мМ) | 1 | 0,2 мМ |
Прямой праймер (10 мкМ) | 1–2 мкл | 0,2–0,4 мкМ |
Обратный праймер (10 мкМ) | 1–2 мкл | 0,2–0,4 мкМ |
Матричная ДНК | Переменный | 10–100 нг (для геномной ДНК высокой сложности) |
ДНК-полимераза Blitz, 2 Ед/мкл | 0,5 мкл | 1 Ед/ реакцию |
H2O, не содержащая нуклеаз | до 50 мкл
|
*
рекомендуемые концентрации для геномной ДНК человекаТаблица 2. Рекомендуемые условия ПЦР для амплификации длинных фрагментов ДНКЭтап цикла | Температура, oС | Время | Количество циклов |
Начальная денатурация | 98 | 30 с | 1 |
Денатурация | 98 | 5 с |
25-35
|
Отжиг | 60 - 72 | 15 с |
Элонгация | 72 | 20 с/1000 п.н. |
Буфер для хранения и разведения: 20 мМ трис-HCl (pH 8,0), 0,5 мМ ЭДТА, 100 мМ KCl, 50 % глицерина, 0,5 % твин-20
СмотретьСкачать