Набор PuriMag Vet для выделения нуклеиновых кислот

Набор PuriMag Vet для выделения нуклеиновых кислот НАЗНАЧЕНИЕ Набор для выделения общей ДНК/РНК PuriMag Vet на основе магнитного сорбента (МГС) предназначен для эффективного выделения общей РНК и ДНК из широкого спектра ветеринарных источников. Набор совместим с многочисленными типами образцов, включая: гомогенаты мышечной ткани; цельную кровь, плазму и сыворотку; фекальные мазки; мазки и пробы; слюну и мочу; конъюнктивальные выделения и спинномозговую жидкость; членистоногих; воду и образцы корма/фуража. ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА Набор для выделения ДНК/РНК PuriMag Vet основан на магнитном сорбенте и позволяет выделять нуклеиновые кислоты из различных материалов. Он также полезен для выделения небольших количеств РНК/ДНК. Очистка РНК/ДНК с помощью набора для выделения ДНК/РНК PuriMag Vet проста и удобна (время экстракции 1 образца – не более 20 минут) и не требует дополнительных реагентов. Набор для выделения ДНК/РНК PuriMag Vet позволяет проводить очистку РНК/ДНК вручную (с помощью магнитного штатива или центрифуги) или в автоматическом режиме с использованием открытых роботизированных станций, таких как Auto-Pure Mini (Allsheng), Auto-Pure 96/32 (Allsheng), KingFisher Flex (Thermofisher Scientific), Tecan Freedom EVO (Tecan) или их аналогов. Набор для выделения ДНК/РНК PuriMag Vet предназначен для проведения исследований 100 образцов объемом 100 мкл (таблица 1). Таблица 1. Состав набора для выделения ДНК/РНК PuriMag Vet Компонент Объем МГС 1 пробирка – 1 мл ETL Buffer 1 пробирка – 45 мл PFW Buffer 1 пробирка – 45 мл ESW Buffer 1 пробирка – 45 мл PEB Buffer 1 пробирка – 12 мл ПРИНЦИП РАБОТЫ Метод выделения нуклеиновых кислот с использованием набора для выделения ДНК/РНК PuriMag Vet основан на связывании нуклеиновых кислот с МГС в присутствии хаотропных солей и их последующей элюции в низкосолевой буфер. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ При работе с набором для выделения ДНК/РНК PuriMag Vet необходимо соблюдать меры безопасности, установленные для соответствующей области деятельности клинической лаборатории ПЦР-диагностики. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ ● ламинарный бокс или ПЦР-бокс ● термошейкер для микроцентрифужных пробирок с температурой нагрева до 65 °C ● микроцентрифуга для пробирок со скоростью вращения не менее 10 000 x g ● пипетки с регулируемым объемом (10–1000 мкл) ● наконечники для пипеток (для предотвращения перекрестного загрязнения необходимо использовать наконечники с аэрозольным барьером) ● микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл или 2 мл ● штативы для микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл или 2 мл ● магнитный штатив для микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл или 2 мл ● холодильник с морозильной камерой (температура от -24 °C до +8 °C) ● одноразовые перчатки без талька ● дезинфицирующая жидкость используется в вашей лаборатории в соответствии с нормативными требованиями ● система очистки нуклеиновых кислот auto-Pure Mini (Allsheng, кат. № AS-17170-00) или аналоги ● 96-луночный планшет: AHN myPlate® с глубокими лунками, 2,2 мл, квадратные лунки, V-образное дно, тип Kingfisher (AHN, кат. № 3-226-04-0) или 96-луночный планшет для Auto-Pure 96/Mini/S32 (Allsheng, кат. № AS-17061-02). ● 6-луночная колонка для образцов (Magbio, кат. № MBNAP16-8W-100) или аналоги. ● 8-позиционный гребенчатый наконечник (Magbio, кат. № MBNAP16-MC-50) или аналоги. При работе с РНК необходимо использовать расходные материалы со специальной маркировкой «Без РНКаз», «Без ДНКаз». ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ ДЛЯ ЭКСТРАКЦИИ Сбор, транспортировка и хранение материалов для исследований осуществляется в соответствии с действующими техническими регламентами, методическими рекомендациями и инструкциями. Некоторые виды собранных жидких образцов (кровь, плазма, сыворотка, спинномозговая жидкость и др.) не требуют предварительной обработки и могут храниться и транспортироваться в соответствии со стандартом. Образцы мочи необходимо хранить и транспортировать в соответствии с инструкциями производителя среды. Образцы мочи требуют предварительной обработки в соответствии с общепринятыми рекомендациями. Рекомендуется центрифугировать 1,5 мл мочи при 10 000 об/мин в течение 10 мин, удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать осадок в 90 мкл буфера TE или 0,9% NaCl. Образцы воды требуют предварительной обработки в соответствии с общепринятыми рекомендациями. Рекомендуется центрифугировать 1,5 мл воды при 10 000 об/мин в течение 15 мин, удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать осадок в 50 мкл буфера TE или 0,9% NaCl. Образцы воды требуют предварительной обработки в соответствии с общепринятыми рекомендациями. Рекомендуется центрифугировать 1,5 мл воды при 10 000 об/мин в течение 15 мин, удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать осадок в 50 мкл буфера TE или 0,9% NaCl. Для приготовления экстракта из корма или тканей рекомендуется приготовить 10% (вес/объем) суспензию ткани в 1 мл 0,9% NaCl с добавлением стеклянных шариков, гомогенизировать образец в течение 3 минут при интенсивном встряхивании и центрифугировать в течение 5 минут на максимальной скорости (10000-14000 об/мин). Надосадочную жидкость можно использовать для последующей экстракции нуклеиновых кислот. Рекомендуется предварительно промыть образцы клещей в 70% этаноле с помощью вихревого перемешивания для удаления потенциальных ингибиторов ПЦР, содержащихся в кутикуле. Для приготовления экстракта из членистоногих рекомендуется приготовить 10% (вес/объем) суспензию членистоногих в 0,5 мл 0,9% NaCl с добавлением стеклянных шариков, гомогенизировать образец в течение 3 минут при интенсивном встряхивании и центрифугировать в течение 5 минут на максимальной скорости (10000-14000 об/мин). Надосадочную жидкость можно использовать для последующей экстракции нуклеиновых кислот. Для мазков кала мы рекомендуем поместить мазок в пробирку, содержащую 0,8 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Встряхивайте пробирку на вортексе в течение 20-30 секунд. Извлеките мазок из пробирки. Центрифугируйте пробирку с образцом в течение 1 минуты при 1000 g для удаления крупных примесей. Перенесите надосадочную жидкость в чистую пробирку. Образец готов к дальнейшему выделению. Все образцы следует тщательно гомогенизировать путем встряхивания на вортексе непосредственно перед экстракцией ДНК/РНК. ЭКСТРАКЦИЯ РНК/ДНК НА МАГНИТНОМ ШТАТИВЕ Установите температуру термостата на 65 °C. 1. МГС, встряхивая на вортексе в течение 10 секунд, перед началом процедуры экстракции. 2. Приготовьте смесь магнитного сорбента и экзогенного внутреннего контроля (EIC — если требуется для конкретного ПЦР-набора) в следующем соотношении на образец: 10*(N+1) мкл МГС + 10*(N+1) мкл EIC (при необходимости), где N — общее количество образцов, включая NEC (контроль отрицательной экстракции), в пробирке объемом 1,5–2 мл. Перемешайте полученное содержимое с помощью вихревого перемешивателя. 3. Добавьте 20 мкл (10, если EIC не требуется) смеси (шаг 2) в пробирки с образцами. 4. Добавьте 100 мкл образца в каждую пробирку (см. раздел «Подготовка образцов»). Добавьте 100 мкл буфера PEB в пробирку с пометкой NEC (контроль отрицательной экстракции). 5. Добавьте 450 мкл буфера ETL в каждую пробирку. 6. Перемешайте содержимое пробирок, используя импульсный вихревой шейкер в течение 5 с, и инкубируйте при 65°C в течение 5 мин с помощью термошейкера (рекомендуется 1200 об/мин). 7. Удалите капли с внутренней стороны крышки, кратковременно центрифугируя на низкой скорости. Поместите пробирки в магнитный штатив для разделения на 60 с. Осторожно удалите надосадочную жидкость, не касаясь МГС. 8. Добавьте 450 мкл буфера PFW и перемешайте содержимое пробирок вихревым шейкером в течение 5 с. 9. Удалите капли с внутренней стороны крышки, кратковременно центрифугируя на низкой скорости. Поместите пробирки в магнитный штатив для разделения на 60 с. Осторожно удалите надосадочную жидкость, не касаясь МГС. 10. Добавьте 450 мкл буфера ESW и перемешайте содержимое пробирок на вортексе в течение 5 с. 11. Удалите капли с внутренней стороны крышки, кратковременно центрифугируя на низкой скорости. Поместите пробирки в магнитный штатив на 60 с. Осторожно удалите надосадочную жидкость, не касаясь МГС. 12. Высушите МГС с открытыми крышками в течение 5 мин при 65°C с помощью термошейкера (рекомендуется 1200 об/мин). 13. Добавьте 50 мкл буфера PEB и перемешайте содержимое пробирок на вортексе в течение 5 с. При необходимости объем буфера PEB можно увеличить до 100 мкл. 14. Инкубируйте пробирки при 65°C в течение 5 мин с помощью термошейкера (рекомендуется 1200 об/мин). После завершения инкубации перемешайте содержимое пробирок на вортексе в течение 5 с.* 15. Удалите капли с внутренней стороны крышки, кратковременно центрифугируя на низкой скорости. Поместите пробирки в магнитный штатив на 2 мин. Надосадочная жидкость содержит очищенные РНК и ДНК, готовые для обратной транскрипции и ПЦР. Настоятельно рекомендуется перенести надосадочную жидкость в новые пробирки для длительного хранения образцов. Образцы можно хранить в течение 24 часов при температуре от +4°C до +8°C, или в течение 1 года при температуре от -24°C до -18°C, или при -80°C в течение длительного периода.