ОПИСАНИЕ ПРОДУКТАДНКаза (свободная от РНКаз) — это эндонуклеаза, которая расщепляет одноцепочечную ДНК (ssDNA), двуцепочечную ДНК (dsDNA) и ДНК-РНК гибриды. Он гидролизует фосфодиэфирные связи с образованием моно- и олигодезоксирибонуклеотидов с 5’-фосфатными и 3’-ОН группами. Активность фермента зависит от присутствия ионов Ca²+, расщепление в присутствии ионов Mg²+ каждой из цепей ДНК происходит случайным образом, а в присутствии ионов Mn²+ расщепление каждой из цепей ДНК происходит приблизительно в одном и том же месте, при этом получаются тупые концы фрагментов ДНК или выступающие на 1-2 нуклеотида.
Фермент ДНКаза I наращивают в рекомбинантном клоне P. pastoris / K.phaffii, экспрессирующего ген ДНКазы I. ДНКаза I может использоваться для обработки ДНК в приложениях, чувствительных к присутствию РНКаз.
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ• удаление геномной ДНК из образцов РНК;
• мечение ДНК методом ник-трансляции (с использованием ДНК-полимеразы I);
• исследования взаимодействий ДНК-белок методом футпринтинга (DNase I footprinting);
• расщепление матрицы ДНК после транскрипции in vitro; • получение библиотек.
Фермент комплектуется 10-кратным реакционным буфером с MgCl2 и без Mg²+
СОСТАВНаименование и характеристики | E-DN-10 | E-DN-100 | Температура хранения |
ДНКаза I, свободная от РНКаз. Концентрация 10 е.а./мкл. Буфер хранения: 10 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 2 мМ CaCl2 , 50% глицерин (v/v) | 1 000 е.а. | 10 000 е.а. | -20°С |
Реакционный буфер ДНКазы I: 10x реакционный буфер: 500 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 50 мМ MgCl2 | 2 x 1.5 мл | 10 x 1.5 мл | -20°С |
Определение единицы активности: одна единица — это количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК Lambda/HinDIII за 10 минут при 37 °C.
УДАЛЕНИЕ ДНК ИЗ ОБРАЗЦОВ РНК. РЕКОМЕНДУЕМЫЙ ПРОТОКОЛ1. Подготовьте стерильную пробирку, свободную от РНКаз
2. Добавьте в пробирку:
№ | Компоненты | Объем/Количество |
1 | РНК | 1мкг |
2 | Реакционный буфер ДНКазы I | 2 мкл |
3 | ДНКаза I | 1-2 е.а |
4 | Деионизованная вода | довести до итогового объема |
| Итоговый объем | 20 мкл |
3. Инкубируйте 15-20 минут при 25-37 °C.
4. Добавьте 1 мкл 100 мМ ЭДТА (конечная концентрация: 5 мМ).
5. Инактивация: инкубируйте 10 минут при 65 °C. При температурной инактивации возможен частичный гидролиз РНК, поэтому мы рекомендуем использовать наборы для очистки РНК от ДНКазы и компонентов буфера, если потери РНК нежелательны.
ВАЖНО! Не перемешивать пипетированием или на вортексе, так как ДНКаза I чувствительна к физической денатурации. Перемешивать только многократным переворачиванием пробирки
ФАСОВКА
| Фермент | Буфер | Хранение |
E-DN-10 | 1 000 е.а. | 2 x 1.5 мл | - 20 °C
|
E-DN-100 | 10 000 е.а. | 10 x 1.5 мл |
СмотретьСкачать