ОПИСАНИЕ ПРОДУКТА Diamant Taq ДНК-полимераза представляет собой термостабильный белок весом 94 KDa, выделенный из штамма E.coli, несущего ген полимеразы pol I Thermus aquaticus (Taqполимераза).
Taq ДНК-полимераза катализирует синтез ДНК в направлении от 5’- к 3’-концу растущей цепи; не обладает детектируемой корректирующей 3’-5’-экзонуклеазной активностью; имеет 5’-3’-экзонуклеазную активность. Кроме того, данный фермент обладает дезоксинуклеотидилтрансферазной активностью, что приводит к присоединению дополнительного остатка dA на 3’-конец ПЦР-продукта.
Taq ДНК-полимераза идеально подходит для рутинной амплификации фрагментов ДНК длиной до 5 000 п.о.
Для удобства пользователей Taq ДНК-полимераза выпускается в нескольких комплектациях: как самостоятельный реагент либо в комплекте с 10-кратным буфером A, состав которого оптимизирован для амплификации ДНК в стандартных условиях, а также раствором 50 мМ MgCl2 для оптимизации условий амплификации.
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯРутинная амплификация фрагментов ДНК длиной до 5 000 п.о.
СТАНДАРТНЫЙ ПРОТОКОЛ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРОДУКТАРекомендуется приготовить общий ПЦР-премикс, содержащий все компоненты смеси (воду, дНТФ, буфер, ДНК-полимеразу, праймеры). Объем ПЦР-премикса рассчитывается исходя из числа реакций с запасом на ошибки пипетирования. После того, как аликвоты ПЦР-премикса будут внесены в предварительно промаркированные ПЦР-пробирки (рекомендуем пластик для ПЦР Omnitip и AHN).
1. Перед использованием разморозить все компоненты ПЦР-смеси.
2. Приготовьте реакционную смесь согласно Таблице 1 (для рутинной ПЦР) и Таблице 2 (для ПЦР с двумеченными зондами).
3. Количество вносимых компонентов приведено для одной реакции объемом 25 мкл.
4. Аккуратно перемешать реакционную смесь и осадить капли со стенок пробирки.
5. Провести ПЦР.
Рекомендуемые условия амплификации для анализа ПЦР-продуктов представлены в Таблице 2 (для рутинной ПЦР).
Таблица 1. Состав реакционной смеси (для рутинной ПЦР) (25 мкл)Компонент | Объем, мкл | Конеч. конц |
10Х буфер А | 2,5 | 1-кратный |
дНТФ, 10 мМ | 0,5 | 200 мкМ |
MgCl2, 50 мM | 1 | 2 мМ |
Прямой праймер, 50 мкМ | 0,2 | 0,4 мкМ |
Обратный праймер, 50 мкМ | 0,2 | 0,4 мкМ |
ДНК-матрица | Определяется пользователем | 10 - 100 нг/ реакцию |
TaqPol (5 ед/мкл) | 0,2 | 0,2-2 ед/реакцию |
H2 O (свободная от нуклеаз) | Довести объем реакционной смеси до 25 мкл
|
Таблица 2. Состав реакционной смеси (для рутинной ПЦР) (25 мкл)Этап | Температура, oС | Время, сек | Кол-во циклов |
Начальная денатурация | 95 | 120 | 1 |
Денатурация | 95 | 15 |
25–40
|
Отжиг праймеров | 55 - 67* | 15 |
Элонгация | 72 | 60 сек. на каждую 1 000 п.о. ** |
Финальная элонгация | 72 | 300 | 1 |
Хранение | 4 | ∞ | 1 |
*
в зависимости от температуры плавления праймеров **
длина амплифицируемого фрагмента не должна превышать 5 000 п.о.Буфер для хранения и разведения: 20 мМ Трис-HCl (pH 8,0); 100 мМ KCl; 0,5 мМ ЭДТА; 50 % глицерин; 0,5 % Tween-20
10Х буфер A:650 mM Трис-HCl (pH 8.8), 166 mM (NH4)2SO4, 0,5 % Tween-20.
УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВКИТранспортировка допускается до 14 дней при температуре не выше 2-8°С
Срок годности при соблюдении условий хранения при температуре от -24°С – -16°С – 1 года c даты производства,
СмотретьСкачать