RevM обратная транскриптаза (ревертаза)

Преимущества:
• Эффективна для GC-богатых РНК-матриц
• Оптимальная рабочая температура 55°С
• Высокая продуктивность

Область применения:
• Синтез первой цепи кДНК для ОТ-ПЦР в реальном времени
• Синтез кДНК для клонирования
• Генерация меченых зондов кДНК для микрочипов
• Мечение РНК
• Анализ РНК методом удлинения праймера

Активность:
200 еа/мкл (50-1 000 еа/мкл по запросу)
Одной единицей определяется количество фермента, который комплементарно встроит 1 нмоль dTTP в растущую цепь ДНК за 30 минут при 74°С в результате реакции обратной транскрипции, используя полиА-dT18 в качестве матрицы для синтеза.

Буфер для хранения и разбавления:
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 mM EDTA, 100 mM KCl, 50% glycerol, 0.5% Tween-20, 1 mM TCEP

Условия хранения и транспортировки:
●От -24°С до -16°С – 1 год
●От +2°С до +8°С – 14 дней

1. Описание

Ревертаза RevM представляет собой генетически модифицированную обратную транскриптазу вируса мышиной лейкемии Молони (MMLV), осуществляющую синтез комплементарной цепи ДНК (кДНК) на матрице одноцепочечной РНК. Благодаря наличию нескольких мутаций у фермента подавлена активность РНКазы Н и повышена термостабильность (оптимальная температура для работы фермента – 55 ^оС, фермент сохраняет активность при температуре до 65 ^оС).
Ревертаза RevM по сравнению с MMLV дикого типа обеспечивает более высокий выход кДНК, позволяет амплифицировать более длинные фрагменты (до 12 000 п.о.), имеет улучшенную эффективность и продуктивность при использовании GC-богатых РНК-матриц.
Ревертаза RevM может поставляться в комплекте с 10-кратным буфером, состав которого оптимизирован для проведения ОТ-ПЦР, а также раствором 50 мМ MgCl₂ для оптимизации условий амплификации.

2. Область применения

Ø Синтез первой цепи кДНК;

3. Стандартный протокол синтеза кДНК с использованием ревертазы RevM

Для уменьшения ошибок пипетирования при постановке нескольких параллельных реакций рекомендуется приготовить общий ПЦР-премикс, содержащий все компоненты смеси (воду, дНТФ, буфер TG, праймеры, ревертазу, ДНК-полимераза, хлорид магния). Рекомендуем использовать специфические, поли-Т и рандомные праймеры для синтеза кДНК. В научных целях мы рекомендуем добавлять фермент после стадии денатурации РНК на льду (70^оС - 5 минут, перенести пробирку со смесью на лед или термоштатив). Объем ПЦР-премикса рассчитывается исходя с запасом на ошибки пипетирования. При работе используйте реагенты, не содержащие РНКазы, включая высокоочищенную воду (R-W1-50) и пластик для ПЦР Omnitip и AHN. Перед использованием разморозить и тщательно перемешать все компоненты смеси.

1.          Перед использованием разморозить и тщательно перемешать все компоненты смеси.
2.          Приготовить реакционную смесь согласно таблице 1. Количество вносимых компонентов приведено для одной реакции объемом 20 мкл.

Таблица 1. Состав реакционной смеси (20 мкл)

3.          Аккуратно перемешать реакционную смесь и осадить капли со стенок пробирки.
4.          Провести реакцию обратной транскрипции, согласно таблице 2 и таблице 3.

Таблица 2. Рекомендуемые условия для Random и олиго(dТ)16-20 праймеров

 

Таблица 3. Рекомендуемые условия для ген-специфических праймеров

 
Для последующего анализа кДНК с применением ПЦР-РВ рекомендуется использовать не более 2 мкл полученного образца на реакцию амплификации объемом 25 мкл.
Образец первой цепи кДНК может храниться не менее месяца при температуре –20 ^оС. Более длительное хранение осуществляется при температуре –70 ^оС.
Буфер для хранения и разведения: 20 мМ Трис-HCl (pH 8,0); 0,5 мМ ЭДТА; 100 мМ KCl; 50 % глицерин; 0,5 % Tween-20; 1 мМ TCEP.

4. Условия хранения и транспортировки

Транспортировка допускается до 14 дней при температуре не выше 4-8°С

Срок годности при соблюдении условий хранения:
- при температуре от -24°С – -16°С – 1 года c даты производства.