ОПИСАНИЕ ПРОДУКТА Мастер-микс для ПЦР 2X Fast Dye это готовая к использованию смесь для полимеразной цепной реакции с интеркалирующим красителем и детекцией в режиме реального времени. Раствор содержит вещества, которые увеличивают время работы и процессивность Тад ДНК-полимеразы за счет повышения ее стабильности во время ПЦР. Мастер-микс для ПЦР 2X Fast Dye содержит ДНК-полимеразу, которая инактивирована антителами и не проявляет ферментативной активности во время приготовления реакционной смеси. Это приводит к повышению специфичности и чувствительности реакции. Активация фермента происходит во время первого цикла денатурации ДНК. В некоторых комплектациях мастер-микс может содержать референсный краситель ROX (в зависимости от прибора для количественной ПЦР конечная концентрация составляет 0,5 мкМ (High ROX) или 0,03 мкМ (Low ROX)).
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ПЦР с интеркалирующим красителем
СТАНДАРТНЫЙ ПРОТОКОЛ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Перед началом анализа важно учесть следующее:
- При использовании зондов для конкретной последовательности наибольшая эффективность ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени наблюдается при длине мишени 70-200 п.н.
- Мастер-микс оптимизирован для конечного объема реакционной смеси 20 мкл. Если используются другие объемы реакционной смеси, необходимо скорректировать количество мастер-микса для ПЦР 2Х Fast Dye по правилу пропорции (см. таблицу 1).
- Для обеспечения наилучших результатов рекомендуется анализировать каждый стандартный или испытуемый образец ДНК в трех повторах.
- Проводят ПЦР в соответствии с параметрами, указанными в таблице 2.
Таблица 1. Схема ПЦР с использованием интеркалирующего красителя и детекцией результатов в режиме реального времени Компонент | Объем/ 20 мкл реакц. смеси | Конечная концентрация |
2X Fast Dye | 10 мкл | 1x |
Прямой праймер | - | 0,1-0,5 мкМ |
Обратный праймер | - | 0,1-0,5 мкМ |
Матричная ДНК | - | От 10 пг до 20 нг |
Н2О, не содержащая нуклеаз | В количестве, необходимом для доведения объема до 20 мкл
|
Таблица 2. Рекомендуемые условия амплификации для ПЦР с использованием интеркалирующего красителя и детекцией результатов в режиме реального времени Этап | Температура, °C | Время | Кол-во циклов |
Начальная денатурация | 95 | 2 мин | 1 |
Денатурация | 95 | 10 c |
35-45
|
Отжиг | 55-65** | 15 c |
Элонгация | 72 | 15 c |
Кривая плавления* | 65-95 | 0,2-0,5°C/c | 1 |
*
Сбор данных FAM/EVAGreen/SybrGreen **
Температура отжига зависит от температуры плавления (Tm) праймеров. Обычно подходящие значения температуры отжига примерно на 2-5°C ниже, чем Тт праймеров. Рекомендуется применять температурный градиент. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВКИ - От -24 до -16°C: 1 год.
- От +2 до +8°C 14 суток.
- Допустимое число циклов замораживания/размораживания: 10.
Только для исследовательской работы. Товар не предназначен для медицинских целей!
ФАСОВКИ Кат.номер | Кол-во реакций | Кол-во реагента в пробирке |
M2-FD-0.25 | 250 | 2,5 мл (2*1,25) |
M2-FD-0.5 | 500 | 6 мл (4*1,25) |
M2-FD-1 | 1000 | 10 мл (8*1,25) |
M2-FD-5 | 5.000 | 50 мл |
M2-FD-10 | 10.000 | 100 мл |
M2-FD-50 | 50 000 | 500 мл (5*100 мл) |
СмотретьСкачать