Blitz Hot-Start ДНК-полимераза
Модификация «горячего старта» ДНК-полимераза BLITZ Hot-Start значительно повышает чувствительность и специфичность ПЦР-анализа.
ДНК-полимераза BLITZ и ДНК-полимераза BLITZ Hot-Start подходят для всех применений ПЦР, требующих большей точности или длинных ампликонов, таких как клонирование, высокоточная и длинноцепочечная ПЦР, подготовка библиотек NGS и «прямая» ПЦР.
Преимущества | • Амплификация длинных фрагментов (до 20 000 п.н.) |
• Повышенная устойчивость к ингибированию | |
• Увеличенная скорость синтеза ДНК (до 3 000 п.н./мин) | |
Область применения | • ПЦР с повышенной точностью синтеза |
• Амплификация длинных фрагментов ДНК | |
• "Прямая" ПЦР без предварительного выделения ДНК | |
• Амплификация NGS-библиотек | |
Концентрация | 2 е.а./мкл |
Одной единицей определяется количество молекул фермента, включающих 15 нмоль дезоксинуклеотидтрифосфатов в растущую цепь ДНК за 30 минут при 74°С. | |
Буфер для хранения и разведения | 20 mМ Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 mМ EDTA, 100 mМ KCl, 50% glycerol, 0.5% Tween-20 |
Условия хранения и транспортировки | • От -24°С до -16°С – 1 год |
• От +2°С до +8°С – 14 дней |
1. ОПИСАНИЕ
ДНК-полимераза Blitz — это фьюжн-белок, состоящий из полимеразы Pfu и ДНК-связывающего домена SSO7d. Этот домен стабилизирует комплекс полимераза - матрица, повышает процессивность, скорость синтеза, точность и стабильность в условиях высокой ионной силы. Фермент катализирует полимеризацию нуклеотидов в направлении 5'→3', а также проявляет 3'→5' экзонуклеазную (корректирующую) активность, которая позволяет полимеразе исправлять ошибки включения нуклеотидов. 5'→3' экзонуклеазная активность отсутствует (не активирует зонды с TaqMan-дизайном).
Модификация «горячего старта» ДНК-полимераза BLITZ HOT-START значительно повышает чувствительность и специфичность ПЦР-анализа.
ДНК-полимераза BLITZи ДНК-полимераза BLITZ HOT-START подходят для всех применений ПЦР, требующих большей точности или длинных ампликонов, таких как клонирование, высокоточная и длинноцепочечная ПЦР, подготовка библиотек NGS и «прямая» ПЦР.
Буфер для хранения и разведения:
20 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 0,5 мМ ЭДТА, 100 мМ KCl, 0,05 % NaN3, 50% глицерина, 0,5% Твин-20.
2,5-кратный реакционный буфер B:
125 мМ Трис-HCl (рН 8,8), 7,5 мМ Mg(OAc)2, 100 мМ ТМАС, 1,5 М Бетаин, 150 мМ KCl, 0,5 мМ ЭДТА, 0,05% NaN3, 0,25% Твин 20.
2. СТАНДАРТНЫЙ ПРОТОКОЛ ПЦР ДЛЯ АМПЛИФИКАЦИИ ДЛИННЫХ ФРАГМЕНТОВ ДНК
1. Для ДНК-полимеразы Blitz без горячего старта рекомендуется готовить мастер-смесь на льду, ДНК-полимераза BLITZ HOT-START не активна до этапа начальной денатурации.
2. Для уменьшения ошибки пипетирования при проведении нескольких параллельных реакций рекомендуется готовить общую ПЦР-премикс, содержащую все компоненты смеси (вода, дНТФ, буфер, ДНК-полимераза, праймеры), за исключением ДНК-матрицы. Объем ПЦР-премикса рассчитывается исходя из количества реакций с добавлением одного дополнительного образца. После добавления ПЦР-премикса в предварительно маркированные ПЦР-пробирки, в них добавляется соответствующая ДНК-матрица.
3. Разморозьте все реагенты, ДНК-матрицу и праймеры.
4. Приготовьте реакционную смесь согласно Табл. 1.
5. Количество каждого компонента указано для одной реакции объемом 50 мкл.
6. Аккуратно перемешайте реакционную смесь и осадите капли со стенок пробирки.
7. Для достижения наилучших результатов рекомендуется проводить анализ каждого стандарта ДНК и образца в трех повторах.
8. Проведите ПЦР-тестирование в соответствии с параметрами, указанными в Табл. 2 с ДНК-полимеразами BLITZ или BLITZ HOT-START.
Таблица 1. Схема проведения реакции ПЦР-амплификации длинных фрагментов ДНК.
Компонент | Объем / для реакции с объемом 50 мкл | Конечная концентрация | |
2,5X Буфер B* | 20 мкл | 1X | |
dNTP mix (каждый нуклеотид в концентрации 10 mM) | 1 мкл | 0.2 мM | |
Прямой праймер (10 мкM) | 1 - 2 мкл | 0.2 – 0.4 мкM | |
Обратный праймер (10 мкM) | 1 - 2 мкл | 0.2 – 0.4 мкM | |
Образец ДНК | Подбирается индивидуально | 10 нг - 100 нг (для GC-богатых ДНК) | |
Blitz ДНК-полимераза (2Ед/мкл) или Blitz Hot-start ДНК-полимераза (2 Ед/мкл) | 0.5 мкл | 1 Ед | |
Вода свободная от нуклеаз | до 50 мкл | ||
Таблица 2. Рекомендуемые условия для ПЦР-амплификации длинных фрагментов ДНК.
Этап | Температура этапа | Время инкубации | Количество циклов | ||
Начальная денатурация | 98°C | 30 с | 1 | ||
Денатурация | 98°C | 5 с | 25-35 | ||
Отжиг | 60 - 72°C | 15 с | |||
Элонгация | 72°C | 20 с / 1000 п.н. | |||
3. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВКИ
ДНК-полимеразу Blitz и ДНК-полимеразу Blitz Hot-Start следует транспортировать при температуре +2 - +8°C (до 14 дней). Допускается транспортировка любым видом транспорта в условиях, обеспечивающих безопасность в соответствии с правилами перевозки грузов, применимыми к данному виду транспорта.
ДНК-полимеразу Blitz и ДНК-полимеразу Blitz Hot-Start следует хранить в заводской упаковке при температуре от -24 °С до -16 °С. Допускается замораживание/оттаивание компонентов набора реагентов до 10 раз.
Срок годности ДНК-полимеразы Blitz и ДНК-полимеразы Blitz Hot-Start составляет 12 месяцев с даты изготовления.